文库制备过程中最重要的 QC 步骤之一发生在 NGS 工作流程开始之前。这一关键 QC 步骤就是分析要使用的起始材料，无论是 DNA 还是 RNA。确保高质量的起始材料是制备高质量文库并获得成功测序结果的第一步。大多数 NGS 文库制备试剂盒建议使用特定的起始浓度和起始量，以获得最佳测序结果。如果起始材料降解或质量较差，可能会难以甚至无法利用样品制备文库。本文将综述常见的 NGS 起始材料基因组 DNA（gDNA）的质控。
gDNA 材料的储存条件可能会影响其完整性。为了了解储存温度对 gDNA 的影响，Permenter 等[1] 比较了室温和 4 °C 下，在不同类型的保存管中储存 1–130 天的 gDNA样品的质量。为了分析降解情况，他们通过使用 TapeStation系统获得的电泳图实现了对样品完整性的可视化，并在150–10000 bp 范围内根据曲线下面积计算了降解程度。完整的样品显示大部分为高分子量物质（超过 10000 bp），表明为完整的 gDNA，而片段化或降解的样品则会在整个指定的降解范围内出现弥散条带（示例参见文献）。在此示例中，质量最高的样品是在 EDTA 管中冷冻保存的样品。DNA 指纹图谱和 SNP 分析等下游分析均表明 gDNA 的质量关系着数据的质量。这为正确处理 gDNA 提供了有价值的信息，并表明了高质量起始材料对于 NGS 等高灵敏度应用的重要性。
在开发新方法时，了解各种程度的条件变化如何影响样品十分重要。例如，在 Zhong 等[2] 的研究中，用不同的方法和试剂对免疫沉淀 DNA 进行纯化，然后考察了所得 DNA 用于 ChIP测序文库和测序时的质量。使用片段分析仪系统测定了不同纯化方法得到的 DNA 样品的分子量（图 1）。结果表明，使用 SPRI 磁珠类试剂进行纯化可消除 100 bp 以下的片段，而纯化柱提取和苯酚氯仿 (PC) 方法则会回收 35 bp 以下的片段。由于ChIP 测序工作流程传统上会进行片段化并选择 100–300 bp 的DNA 进行测序，因此基于纯化柱和 SPRI 磁珠的纯化方法不会影响其测序覆盖率。但是，作者指出，对于需要 100 bp 以下片段的应用，在计划实验时应考虑样品纯化方法和所得样品分子量。
成功的文库制备和测序结果需要高质量核酸。为了帮助鉴定合格质量的样品，安捷伦开发了多种质量评分，专门针对不同的自动化电泳平台。这些质量指标为用户提供了可靠的样品完整性评估，减少人为错误和用户评估之间的差异，节省了时间和成本，同时可轻松识别会导致不良结果的不合格样品。例如，片段分析仪和 Femto Pulse 系统可以利用基因组质量值(GQN) 评估经过打断的 gDNA。对于这一评分，用户可以根据具体应用设定阈值并应用于样品。然后，根据测得的高于指定分子量阈值样品的总浓度分数计算 GQN 值。GQN 按 0 到 10 的等级对样品进行评分，0 表示样品均未超过分子量阈值。10 表示样品 100% 高于分子量阈值。此外，TapeStation 系统可提供有关 gDNA 质量的 DNA 完整值 (DIN)，这是一个不受用户影响的客观评分。DIN 按 1 到 10 对样品进行评分。高 DIN 代表高度完整的 gDNA，而低 DIN 则代表高度降解的 gDNA 样品。对福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 组织的处理尤为困难，因为为了长期保存，通常采用化学方法固定。可以从此类组织中提取核酸，但由于保存技术导致的交联和降解，其质量通常低于新鲜组织。低质量的核酸导致 FFPE 样品难以用于 NGS 等高灵敏度的下游分析。但是，通过确定样品的质量，并对如何优化文库制备方案做出明智决策，可以实现对 FFPE 样品的成功测序。例如，Muscarella 等[3] 评估了通过不同提取方法获得的 FFPE gDNA 的 TapeStation DIN 值，以帮助确定用于肿瘤学研究的可靠 NGS 工作流程。作者指出：“ DIN 值使电泳图解析更容易，有利于样品间的比较，并为 NGS 技术提供了出色的实验重现性和高质量基因组 DNA 的定量。” [3] 所有使用手动或自动试剂盒提取的样品均显示 DIN > 4.4，试剂盒之间的质量没有显著差异。苯酚-氯仿提取的样品质量明显偏低，其中一个样品的 DIN 值为 1.9，还有两个样品严重降解，无法计算 DIN 值。每种试剂盒的代表性示例以及每种方法的平均 DIN 值如图 2 所示。每种提取方法得到的样品均用于 NGS 文库制备，并使用 TapeStation 系统对所得文库的质量进行评估。每个文库表现出相似的扩增模式，浓度分布均匀。尽管所有样品均提供了良好的测序结果，但作者指出，采用自动化方法提取 FFPE gDNA 可以节省时间和昂贵的试剂，且质量优于手动方法，并获得了更高质量的测序数据。
安捷伦自动化电泳仪提供了一系列试剂盒，可兼容多种样品类型和分子量，可提供准确可靠的分子量测定、定量和摩尔浓度。此外，每种仪器均采用专为平台优化的特定质量指标，可对样品完整性进行客观评估。尽管不同类型的仪器质量指标的计算有所不同，但最终的质量评分在不同平台间具有很高的可比性。多篇文献均证明自动化电泳仪非常适合这类重要的 QC 步骤，不仅适用于传统的 NGS 文库制备，还可用于故障排除和方案优化，以及为复杂或独特样品开发定制工作流程。
参考文献：
- Permenter, J.; Ishwar, A.; Rounsavall, A.; Smith, M.; Faske, J.; Sailey, C. J.; and Alfaro, M. P. Quantitative Analysis of Genomic DNA Degradation in Whole Blood Under Various Storage Conditions for Molecular Diagnostic Testing. Mol. Cell Probes 2015, 29, 449–453
- Zhong, J.; Ye, Z.; Lenz, S. W.; Clark, C. R.; Bharucha, A.; Farrugia, G.; Robertson, K. D.; Zhang, Z.; Ordog, T.; and Lee, J. H. Purification of Nanogram-Range Immunoprecipitated DNA in ChIP-seq Application.BMC Genomics 2017, 18, 985.